饲料中真蛋白的检测方法

凯氏定氮法 网上没找到 ，就自己打了一份

饲料中纯蛋白质（真蛋白）的测定

一 、测定原理

饲料蛋白质经沸水提取并在碱性溶液中被硫酸铜沉淀 。过滤和洗涤后
，可将纯蛋白质和非蛋白质含氮物分离，再用凯氏定氮法测定沉淀物中的蛋白质含量
。

二
、仪器设备

（1）烧杯：200ml

（2）定型滤纸

（3）其他设备与粗蛋白质测定法相同

三、试剂与配制

（1）100g.L-1硫酸铜溶液；分析纯硫酸铜（5水硫酸铜）10g溶于100ml水中

（2）25g.L-1氢氧化钠溶液：将2.5g分析纯氢氧化钠溶于100ml水中

（3）10g.L-1氯化钡溶液：1g氯化钡溶于100ml水中

（4）2mol.L盐酸溶液

（5）其他试剂与粗蛋白质测定法相同

四 、测定步骤

准确称取试样1g左右（精确至0.0001g）置于200ml烧杯中 ，加50ml水中，加热至沸。

加入20ml硫酸铜溶液
，20ml氢氧化钠溶液，用玻璃棒充分搅拌 ，放置1h以上 。用定性滤纸过滤
，然后用60~80摄氏度热水洗涤沉淀5或6次，用氯化钡溶液5滴和盐酸溶液1滴检查滤纸 ，直至不生成白色硫酸钡沉淀为止。将沉淀和滤纸放在65摄氏度烘箱干燥2h
，然后全部转移到凯氏烧瓶中，按半微量凯氏定氮法进行氮的测定
。

植物全氮、磷
、钾的测定？

凯氏定氮法

蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法介绍

GB/T 5009.5—1985

食品中蛋白质的测定方法

本标准适用于各类食品中蛋白质的测定.

1 原理

蛋白质是含氮的有机化合物.食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵.然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量.

2 试剂

所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制.

2.1 硫酸铜.

2.2 硫酸钾.

2.3 硫酸.

2.4 2%硼酸溶液.

2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合.也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合.

2.6 40%氢氧化钠溶液.

2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液.

3 仪器

定氮蒸馏装置：如图所示.

（图略）

4 操作方法

4.1 样品处理：精密称取0.2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ml液体样品(约相当氮30～40mg),移入干燥的 100ml或500ml定氮瓶中,加入0.2g硫酸铜,3g硫酸钾及20ml硫酸,稍摇匀后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上.小心加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热0.5h.取下放冷,小心加20ml 水.放冷后,移入100ml容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用.取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾 、硫酸按同一方法做试剂空白试验.

4.2 按图装好定氮装置,于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处,加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠以防暴沸,用调压器控制,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水.

4.3 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室,并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内,塞紧小玻杯的棒状玻塞.将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯,提起玻塞使其缓缓流入反应室,立即将玻塞盖紧,并加水于小玻杯以防漏气.夹紧螺旋夹,开始蒸馏.蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内,蒸馏5min.移动接受瓶,使冷凝管下端离开液面,再蒸馏1min.然后用少量水冲洗冷凝管下端外部.取下接收瓶,以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点.

同时吸取10.0ml试剂空白消化液按4.3操作.

4.4 计算

式中：X——样品中蛋白质的含量,%；

V1——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积,ml；

V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积,ml；

N——硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

0.014——1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

m——样品的质量(体积),g(ml)；

F——氮换算为蛋白质的系数.蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%,按16%计算乘以6.25即为蛋白质,乳制品为6.38,面粉为5.70,玉米
、高粱为6.24,花生为5.46,米为5.95,大豆及其制品为5.71,肉与肉制品为6.25,大麦、小米 、燕麦
、裸麦为5.83,芝麻、向日葵为 5.30.

附加说明：

本标准由全国卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出,由卫生部食品卫生监督检验所归口.

本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草.

一 、植株全氮的测定

1.方法原理

植株样品用浓硫酸加双氧水消煮 ，使有机氮转化为铵盐。铵盐经碱化后形成氨
，经蒸馏将氨吸收到硼酸溶液中 。以甲基红—溴甲酚绿为指示剂，用标准酸滴定 ，测定植株中的全氮含量（不包括全部硝态氮）
。

2.分析步骤

2.1 试样溶液制备

称取试样0.5g
，精确至0.001g，置于50ml消煮管（5.1）中（勿将样品粘附在瓶颈上）。先滴入少些水湿润样品 ，然后加8mL硫酸（4.1），轻轻摇匀并放置过夜 。在管口放一弯颈小漏斗（5.3）
，在消煮炉上先250℃消煮（温度稳定后计时，时间约30min） ，待H2SO4分解冒出大量白烟后再升高温度至400℃
，当溶液呈均匀的棕黑色时取下
。（时间约3h），稍冷后加10滴H2O2（注1） ，摇匀
，再加热至微沸（注2），消煮约5min ，取下稍冷后
，重复加H2O2 5-10滴，再消煮。如此重复3-5次 ，每次添加的H2O2的量应逐次减少
，消煮到溶液呈无色或清亮后（应该为水的颜色），再加热约5-10min ，以除尽剩余的H2O2 。将消煮管取下，冷却
。并用少量水冲洗弯颈漏斗
，洗液流入消煮管。将消煮液无损的洗入100mL容量瓶中，用水定容 ，摇匀 。过滤或放置澄清后供氮的测定
。

2.2 空白试验

除不加试样外
，试剂用量和操作与测定试样时相同。

2.3 测定

2.31蒸馏前将配制好的氢氧化钠（4.3），硫酸标准液（4.6） ，混合指示剂（4.5）
，对定氮仪进行充分预热，进行空蒸镏清洗管道 ，直至读数稳定 。

2.32 吸取上述待测液10.00mL（含NH4—N约1mg）
，注入凯氏定氮仪蒸馏管中，参数设置后 ，对待测液进行测定
，其中加碱时间应设为3S。

二
、植物全磷的测定

1.方法原理

物样品经硫酸-过氧化氢消煮使各种形态的磷转变成正磷酸
。待测液中的正磷酸与偏钒酸和钼酸能生成**的三元杂多酸,其吸光度与磷浓度成正比,可在波长400～490nm处用吸光光度法测定。磷浓度较高时选用较长的波长,较低时选用较短波长 。

2.分析步骤

2.1试样溶液制备

称取试样0.5g，精确至0.001g ，置于50ml消煮管（5.1）中（勿将样品粘附在瓶颈上）
。先滴入少些水湿润样品，然后加8mL硫酸（4.1）
，轻轻摇匀并放置过夜。在管口放一弯颈小漏斗（5.3），在消煮炉上先250℃消煮（温度稳定后计时 ，时间约30min）
，待H2SO4分解冒出大量白烟后再升高温度至400℃，当溶液呈均匀的棕黑色时取下 。（时间约3h） ，稍冷后加10滴H2O2（注1）
，摇匀，再加热至微沸（注2） ，消煮约5min
，取下稍冷后，重复加H2O2 5-10滴 ，再消煮
。如此重复3-5次
，每次添加的H2O2的量应逐次减少，消煮到溶液呈无色或清亮后（应该为水的颜色） ，再加热约5-10min，以除尽剩余的H2O2。将消煮管取下
，冷却 。并用少量水冲洗弯颈漏斗，洗液流入消煮管
。将消煮液无损的洗入100mL容量瓶中 ，用水定容
，摇匀。过滤或放置澄清后供磷的测定 。

2.2 空白溶液制备

除不加试样外，应用的试剂和操作步骤同2.1
。

2.3 标准曲线绘制

吸取磷标准溶液（4.7）0 ，1.00
，2.50，5.00 ，7.00
，10.00，12.50 ，15.00mL分别置于8个50mL容量瓶中
，加入与吸取试样溶液等体积的空白溶液，加水至30mL左右 ，加2滴二硝基酚指示剂（4.6），用氢氧化钠溶液（4.5）和硫酸（4.8）调节溶液呈微**
，加10mL钒钼酸铵溶液（4.4）摇匀，用水定容。此溶液磷含量为0, 1.00, 2.50 , 5.00, 7.50, 10.00, 12.50 ，15.00 mg/L的标准溶液系列 。在室温15℃以上条件下放置20min后（最长不超过4h）
，在分光光度计波长440nm处用1cm光径比色皿，以空白溶液调节仪器零点 ，进行比色
，读取吸光度。根据磷浓度和吸光度绘制标准曲线或求出直线回归方程
。

2.4 准确吸取定容,过滤或澄清后的消煮液10.00ml放入50ml容量瓶中，加水至30mL左右 ，

与标准系列同条件显色、比色
，读取吸光度。

三 、植物全钾的测定

1.方法原理

植株样品经硝酸
、高氯酸消煮后，消化液中的钾用火焰分光光度计测定 。火焰分光光度法是利用火焰做激发源 ，使钾原子激发
。根据激发出能量的大小测定钾素的含量。

2.分析步骤

2.1试样溶液制备

称取试样0.5g
，精确至0.001g，置于50ml消煮管（5.1）中（勿将样品粘附在瓶颈上） 。先滴入少些水湿润样品 ，然后加8mL硫酸（4.1），轻轻摇匀并放置过夜
。在管口放一弯颈小漏斗（5.3）
，在消煮炉上先250℃消煮（温度稳定后计时，时间约30min） ，待H2SO4分解冒出大量白烟后再升高温度至400℃
，当溶液呈均匀的棕黑色时取下。（时间约3h），稍冷后加10滴H2O2（注1） ，摇匀
，再加热至微沸（注2），消煮约5min ，取下稍冷后
，重复加H2O2 5-10滴，再消煮 。如此重复3-5次 ，每次添加的H2O2的量应逐次减少
，消煮到溶液呈无色或清亮后（应该为水的颜色），再加热约5-10min ，以除尽剩余的H2O2
。将消煮管取下，冷却。并用少量水冲洗弯颈漏斗
，洗液流入消煮管 。将消煮液无损的洗入100mL容量瓶中，用水定容 ，摇匀
。过滤或放置澄清后供钾的测定。

2.2空白溶液制备

除不加试样外
，应用的试剂和操作步骤同2.1 。

2.3 标准曲线绘制

准确吸取钾标准溶液（4.3）0, 1.00, 2.50, 10.00, 20.00 ml, 分别放入50mL容量瓶中, 加入与吸取试样溶液等体积的空白溶液，(使标准溶液中的离子成分和待测液相近),加水定容。即得0, 2, 5, 10, 20, 40 mg/L K标准系列溶液
。在火焰光度计上 ，以浓度最高的标准溶液定火焰光度计检流计的满度(一般只定到90),以空白溶液调节仪器零点
，然后从稀到浓依次进行测定,记录检流计读数,以检流计读数为纵坐标,钾浓度为横坐标绘制校准曲线或求直线回归方程。

2.4 测定

吸取定容后的消煮液10.00mL放入50mL容量瓶中,用水定容，直接在火焰光度计上测定,读取检流计读数 ，每5个样品必须用钾标准溶液校正仪器 。